端粒酶活性檢測試劑盒
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【產(chǎn)品規(guī)格】
BPT50 50T (50人份 ，其中5個組分按5個10人份單獨包裝，Biowing? Specific Reverse Transcription Primer按20μL*2單獨包裝。)
【產(chǎn)品說明】
端粒酶 (Telomerase ) 是一種酶促核糖蛋白復合物。其催化亞基 (TERT) 具有逆轉(zhuǎn)錄酶的特
性，TERT被認為是端粒酶活性表達的關鍵組分，其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致，與端粒酶的 活化程度密切相關。因此，對端粒酶催化亞基的檢測可以間接反映樣本中端粒酶活性。
本產(chǎn)品試劑盒采用雙色熒光qPCR (TaqMan探針法) 檢測端粒酶催化亞基TERT基因和內(nèi)參基因***DH 。通過提取細胞RNA ，利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應， 以cDNA為模板在單管中利用多重熒光定量PCR進行擴增反應 (雙重探針：FAM 、Cy5) 。選用293T細胞為陽性對照以及MRC-5細胞為陰性對照，判斷樣本中是否有TERT基因表達。該試劑盒具有以下特點：
1. 靈敏：雙色探針，靈敏度高。
2. 穩(wěn)定：全程閉管操作，無交叉污染。
3. 可靠：含內(nèi)參基因，避免假陰性。
4. 方便：操作簡單，無需電泳步驟。
5. 定量： 以CT值判斷，可定量檢測。
【運輸及保存條件】
低溫冷凍運輸 ，避光-20℃保存 ，有效期6個
月。開蓋后，4℃保存，有效期1周。
【產(chǎn)品組分】
組分名稱 | BPT50 |
Biowing? Specific Reverse Transcription Primer | 20μL*2 |
Biowing?qPCR Mix | 312μL*5 |
Biowing?Probe qPCR Primer | 90μL*5 |
Positive Control | 10μL*5 |
Negative Control | 10μL*5 |
RNase Free Water | 200μL*5 |
注：1.本試劑盒提供試劑，使用前先低速離心、后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用；2.為了避免反復凍融，10人份/管作為一個包裝。
【操作步驟】
1. 逆轉(zhuǎn)錄反應
使用Trizol法抽提細胞RNA ，RNA純度A260/280在1.9-2.0之間。取1ug RNA使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：K1622 )，將試劑盒中的 Random Primer 替換成Biowing? Specific Reverse Transcription Primer進行反轉(zhuǎn)錄反應得到cDNA。
1. 1 DNase I處理
RNA (μg) | DNase Buffer (μL) | DNase Ⅰ( μL) | DEPC 水(μL) |
1 | 1 | 1 | To 10 |
反應程序：37℃ 30min ；加 EDTA 1 μL 后，65℃ ，10min
1.2 逆轉(zhuǎn)錄反應
RNA( μL) | Biowing? Specific Reverse Transcription Primer( μL) | 5×Buffer ( μL) | RT( μL) | RI( μL) | dNTP(μL) |
5.5 | 0.5 | 2 | 0.5 | 0.5 | 1 |
反應程序：20℃ 10min ；42℃ 1h；72℃ 5min
2. qPCR反應體系及條件
2. 1 陽性對照處理
將陽性對照cDNA進行4倍、8倍的梯度稀釋，每個梯度建議三重復。
2.2 陰性對照處理
將陰性對照cDNA進行4倍、8倍的梯度稀釋，每個梯度建議三重復。
2.3 樣本處理
將待測樣本cDNA進行4倍稀釋作為測試濃度，每個樣本做三重復。
反應體系 (以20μL為例)
組分/樣品管 | 待測樣品(μL) | 陽性對照管(μL) | 陰性對照管(μL) |
Biowing?qPCR Mix | 10.4 | 10.4 | 10.4 |
Biowing?Probe qPCR Primer | 3 | 3 | 3 |
Sample | 3 | 0 | 0 |
Positive Control | 0 | 3 | 0 |
Negative Control | 0 | 0 | 3 |
RNase Free Water | 3.6 | 3.6 | 3.6 |
PCR儀設置 (以ABI 7500為例)
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | |
1 | 預變性 | 1 | 94℃ | 5 min |
2 | 變性 |
40 | 95℃ | 15 s |
退火 | 58℃ | 45 s | ||
延伸 | 72℃ | 1 min | ||
溫度選擇：72℃延伸時收集熒光信號 | ||||
通道選擇：樣本檢測通道-FAM； 內(nèi)參檢測通道-Cy5 | ||||
【基線設置】(以ABI 7500為例)
一般默認起始和終止基線位置為3- 15個循環(huán)，應根據(jù)內(nèi)參基因和TERT基因?qū)嶋H擴增曲線手動將基線起始循環(huán)數(shù)調(diào)整為指數(shù)增長期之前即可。
【閾值設置】(以ABI 7500為例)
內(nèi)參閾值設定： 以陽性對照4倍稀釋cDNA定內(nèi)參基因擴增曲線閾值， 內(nèi)參基因(Cy5)初始濃度的CT值定 為17±3；
TERT閾值設定： 以陽性對照4倍稀釋cDNA定TERT基因擴增曲線閾值，TERT基因(FAM)初始濃度CT值 的定為25±3。
【結(jié)果判讀】
圖1 左: 陽性對照的擴增曲線；右: 陰性對照的擴增曲線
(藍色為TERT基因曲線,黃綠色為內(nèi)參基因曲線)
1. 陽性對照4倍稀釋后TERT基因Ct值在25±3，內(nèi)參基因Ct值在17±3，8倍稀釋后TERT基因Ct值在26±3，內(nèi)參基因Ct值在18±3 。TERT基因和內(nèi)參基因之間?CT維持在9±3，保持穩(wěn)定。
2. 陰性對照經(jīng)4倍、8倍梯度稀釋后，TERT基因Ct值≥35 (或檢測不到) ，內(nèi)參基因Ct值仍在18±3之間，判定為端粒酶活性為陰性。
3. 結(jié)果說明
若待測樣本內(nèi)參基因Ct值在17±3之間，TERT基因Ct值＜35且擴增曲線正常，則樣本端粒酶活性為陽性。
若待測樣本內(nèi)參基因Ct值在17±3之間，TERT基因Ct值≥35且無明顯的擴增曲線，則樣本無端粒酶活性。
【說明】
1. 待測樣本cDNA 4倍稀釋作為模板，三次技術重復，不設置梯度稀釋；陽性對照、陰性對照進行4倍、8倍梯度稀釋，建議分別做三重復；避免偶然誤差的產(chǎn)生。
2. 如果陽性/陰性對照4倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值＞20，表明參考品有降解或者試劑盒擴增效率下降。
3. 如果所有樣本4倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值＞20，表明試劑盒的擴增效率下降。
4. 如果陽性對照4倍稀釋后TERT基因Ct值＞28 ，表明TERT基因檢測系統(tǒng)失效。
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