細(xì)胞線粒體/血清游離線粒體拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

【產(chǎn)品規(guī)格】

MtDNAcn 50  50*3 Reaction

【產(chǎn)品說(shuō)明】

線粒體是細(xì)胞的“能量工廠”和自由基代謝中心，線粒體功能與線粒體DNA（mtDNA）的數(shù)量和質(zhì)量緊密相關(guān)。線粒體DNA的數(shù)量，即線粒體DNA拷貝數(shù)。mtDNA拷貝數(shù)變異引起線粒體功能紊亂，與衰老及多種疾病如糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤等密切相關(guān)。

細(xì)胞基因組DNA抽提試劑盒獲得的DNA中包含了基因組DNA和線粒體DNA。研究人員一般利用每個(gè)細(xì)胞中線粒體DNA拷貝數(shù)（例如：300拷貝/細(xì)胞）作為一個(gè)相關(guān)研究參數(shù)。

外周血游離線粒體DNA（circulating cell free mitochondrial，ccfmtDNA）：是血液中游離細(xì)胞外的線粒體DNA，其來(lái)源可能有內(nèi)源性和外源性兩條途徑，一方面源自于體內(nèi)腫瘤組織的凋亡、壞死或腫瘤細(xì)胞的內(nèi)分泌作用；另一方面可能來(lái)源于體外凝血過(guò)程中白細(xì)胞的釋放。ccfmtDNA可作為一種非侵襲性的潛在適用性較大的腫瘤標(biāo)志物。科研人員一般利用每毫升血液或每毫升血清中游離線粒體DNA拷貝數(shù)（例如：300拷貝/1mL全血、300拷貝/1mL血清）作為一個(gè)相關(guān)研究參數(shù)。

游離線粒體DNA抽提注意事項(xiàng)：

1. 使用EDTA抗凝采集管采集新鮮血液樣本，肝素抗凝不可使用。

2. 需要定量全血樣本使用量（2mL或3mL）。

3. 血液樣本采集并定量后，30分鐘內(nèi)分離血清。3000-3500轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘。

 4. 分離后的血清建議立即使用游離DNA抽提試劑盒進(jìn)行抽提。如無(wú)條件立即抽提，請(qǐng)將分離后的血清儲(chǔ)存于-20℃冰箱。

本產(chǎn)品試劑盒采用雙色熒光 qPCR（FAM+HEX）檢測(cè)線粒體DNA拷貝數(shù)，提供已知線粒體DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品及校正品。利用標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，校正品校正后進(jìn)行絕對(duì)定量，檢測(cè)對(duì)象為細(xì)胞基因組DNA樣本、游離DNA樣本。

【運(yùn)輸及保存條件】

低溫冷凍運(yùn)輸， -20℃保存，有效期 1 年，凍融以后，4℃保存，有效期1周。

【產(chǎn)品組分】

注：

v 本試劑盒提供試劑，使用前請(qǐng)上下輕柔顛倒十次混勻，后低速離心、小心開(kāi)啟。避免起泡。

v Standard A是已知線粒體DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

v Standard B是已知線粒體DNA拷貝數(shù)的校正品，經(jīng)過(guò)計(jì)算可得出校正系數(shù)。

【操作步驟】

1. 樣品質(zhì)控及使用

DNA純度A260/A280 ≈ 1.8，濃度標(biāo)化為10ng/μL，上樣2μL。每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品使用

Standard A以兩倍梯度稀釋，形成3個(gè)濃度梯度（原液、2倍稀釋、4倍稀釋后分別得到DNA總量為40ng、20ng、10ng的DNA溶液），每個(gè)濃度梯度3次重復(fù)，上機(jī)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品Standard A分別形成線粒體靶標(biāo)基因和基因組核單拷貝基因的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。Standard B直接原液上樣2μL。

3. qPCR反應(yīng)液的準(zhǔn)備

(1) 根據(jù)所要檢測(cè)樣品的數(shù)量，計(jì)算所需反應(yīng)孔數(shù)，每個(gè)樣本做3 個(gè)重復(fù)孔。

反應(yīng)孔數(shù)=（3個(gè)StandardA）× 3個(gè)梯度+（ 1個(gè)校正標(biāo)準(zhǔn)品StandardB +陰性質(zhì)控 +樣本數(shù)）× 3

(2) 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算所需的 Mix 總量（含有 1孔的加樣損失量）：

Mix =（反應(yīng)孔數(shù)+1）× 18μl

(3) 各試劑放 2-8℃條件下融化，并根據(jù)下表所示準(zhǔn)備 qPCR Mix：

4. 加樣

（1）震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。

（2）向每孔反應(yīng)管中分裝 18μL qPCR Mix。

（3）向已分裝過(guò) qPCR Mix 的反應(yīng)管中加入10ul石蠟油。

（4）向反應(yīng)管中加入樣品后短暫離心，加樣示例如下：

注：蓋上八聯(lián)管蓋或者光學(xué)膜后蓋上反應(yīng)管蓋子或者貼上光學(xué)膜，為避免影響熒光信號(hào)讀取，請(qǐng)注意不要在管蓋或者膜上做標(biāo)記，或者用刮板反復(fù)摩擦。反應(yīng)管短時(shí)低速離心，將管壁液體收集至管底；充分震蕩混勻后，再短時(shí)低速離心，將管蓋和管壁的殘留液體收集至底，如有氣泡，需將氣泡排盡

5. qPCR反應(yīng)條件

PCR儀設(shè)置以 ABI 7500為例，其他型號(hào)定量PCR儀應(yīng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行參數(shù)校正或咨詢專業(yè)技術(shù)人員。

【基線設(shè)置】

線粒體拷貝檢測(cè)擴(kuò)增曲線基線設(shè)定：以標(biāo)準(zhǔn)品A基線設(shè)定線粒體基線，將基線設(shè)定為3~9個(gè)循環(huán)。

核單拷貝基因檢測(cè)擴(kuò)增曲線基線設(shè)定：以標(biāo)準(zhǔn)品A基線設(shè)定內(nèi)參基線，將基線設(shè)定為3~9個(gè)循環(huán)。

【閾值線設(shè)置】

線粒體拷貝檢測(cè)擴(kuò)增曲線閾值設(shè)定：以標(biāo)準(zhǔn)品A的CT值設(shè)定線粒體擴(kuò)增曲線閾值，將3梯度標(biāo)準(zhǔn)品A線粒體的 CT 值定為16-20 。

2N基因組拷貝檢測(cè)擴(kuò)增曲線閾值設(shè)定：以標(biāo)準(zhǔn)品A的CT值設(shè)定內(nèi)參擴(kuò)增曲線閾值，將3梯度標(biāo)準(zhǔn)品A內(nèi)參的 CT 值定為 24-28。

說(shuō)明：

如果標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)參CT 值>31，但陰性對(duì)照管的內(nèi)參CT 值正常， 表明操作有誤，試劑盒擴(kuò)增效率下降或儀器運(yùn)行障礙。

StandardA、StandardB的線粒體拷貝數(shù)，請(qǐng)咨詢上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司。產(chǎn)品批次不同，線粒體DNA拷貝數(shù)會(huì)有差異。

                                                     注：本說(shuō)明書(shū)版本為MtDNAcn20230501。

【附錄】

1.細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)計(jì)算方法：

v 將已知拷貝數(shù)的Standard A原液，2倍梯度稀釋后構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)Y為log₂濃度，橫坐標(biāo)X為CT值，分別繪制線粒體基因和內(nèi)參基因的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并添加線性趨勢(shì)線，導(dǎo)出擬合方程。

圖示：

v 將已知拷貝數(shù)的Standard B對(duì)應(yīng)基因CT值分別代入Standard A的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程中，得到的數(shù)值相比得到一系數(shù)k1，計(jì)算Standard B的實(shí)際測(cè)量值（k1*Standard A mtDNAcn）。根據(jù)公式，Standard B mtDNAcn/（k1*Standard A mtDNAcn）得到樣本計(jì)算時(shí)的校正系數(shù)K2。

例如：假定StandardA線粒體DNA拷貝數(shù)為300，StandardB線粒體DNA拷貝數(shù)為330

v 將樣本的線粒體DNA CT值和核單拷貝基因CT值分別帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到的數(shù)值相比得到樣本系數(shù)K3，根據(jù)公式K3*K2*Standard A mtDNAcn，即可對(duì)樣本線粒體DNA拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量。（K3*K2為樣本校正后系數(shù)）。