檢測原理：雙色熒光探針分別檢測端粒酶催化亞基TERT基因mRNA和內(nèi)參基因GAPDH mRNA。在進行樣本檢測時，

同時檢測陽性細胞293T和陰性MRC-5細胞做為對照，利用??CT法計算樣本中TERT基因的相對表達量。

檢測所用試劑及儀器

1. 檢測所用試劑

RNA抽提試劑盒：FineProtect通用型RNA提取試劑盒(Code No.203，濟凡生物科技(常州)有限公司，中國)

RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒： RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(00820611，Thermo scientific，Germany)

雙色熒光TERT基因檢測試劑盒：上海翼和應用生物技術有限公司自研

陽性對照：293T細胞

陰性對照：MRC-5細胞（正常的人胚肺細胞） 

2. 檢測所用主要儀器

熒光定量PCR： Real Time PCR System(SLAN-96S，中國)

RNA質(zhì)控：Nanodrop 2000C Spectrophotometer(Thermo scientific，Germany）

實驗目的及步驟

1. 實驗目的

      利用多重TaqMan探針的方法，以端粒酶活性陽性293T細胞和陰性MRC-5細胞做對照，檢測樣本端粒酶催化亞

基TERT基因表達量。

2. 逆轉(zhuǎn)錄反應

1).DNase Ⅰ處理

                                    反應程序：37℃ 30min；加EDTA 1 μL 后，65℃，10min

2).逆轉(zhuǎn)錄反應

                                   反應程序：20℃ 10min；42℃ 1h；72℃ 5min

3.qPCR（20ul體系）

                                  反應程序：94℃ 5min （95℃ 15s ，58℃ 45s ，72℃ 1min）*40

判讀標準

1. 陽性對照4倍稀釋后TERT基因Ct值在25±3，內(nèi)參基因Ct值在17±3，8倍稀釋后TERT基因Ct值在26±3，內(nèi)參基因Ct值在18±3，對照品

端粒酶活性為陽性，顯示實驗穩(wěn)定檢出陽性樣本的TERT基因表達量。

2. 陰性對照經(jīng)4倍、8倍梯度稀釋后，TERT基因Ct值≥35（或檢測不到），內(nèi)參基因Ct值仍在18±3之間，陰性對照品端粒酶活性為陰性。

定量PCR擴增曲線

                                                                          圖1  左:陽性細胞293T的擴增曲線,右: 陰性細胞MRC-5的擴增曲線                                                                           （藍色為TERT曲線，紅色為內(nèi)參GAPDH曲線）