【產(chǎn)品規(guī)格及貨號(hào)】

HRAP-50；50反應(yīng)/盒

【產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)】

方便：操作簡(jiǎn)單，可直擴(kuò)檢測(cè)。

靈敏：微量核酸即可檢測(cè)。

特異性：不與其他類似物產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

【運(yùn)輸及保存條件】

低溫冷凍運(yùn)輸，-20℃保存，其中保存液和裂解液4℃保存，反復(fù)凍融次數(shù)低于3次，有效期 1年。

【自備儀器】

SLAN96或其他四色熒光定量PCR儀、離心機(jī)。

【產(chǎn)品組分】

A:

B:

注：若采用直擴(kuò)法需自行采購保存液和裂解液（貨號(hào)：CL-50）

【操作步驟】

1. 試劑的復(fù)溶：

檢測(cè)液和陽性質(zhì)控先12000 rpm離心5 min，再分別用75 μL/管和50 μL/管 RNase Free Water復(fù)溶，混勻1min，再瞬離。

2. 樣本制備（自備）

A 樣本的標(biāo)準(zhǔn)制備方案：請(qǐng)使用高效DNA 提取試劑盒提取人口腔黏膜、全血或新鮮組織樣本的DNA。推薦使用無微生物污染級(jí)別的核酸提取試劑盒。

B 樣本的簡(jiǎn)易快速制備方案：可用于人口腔拭子，樣本制備步驟如下。

（1）采集口腔拭子（1根），存放于口腔拭子保存液中。保存液存放于1.5 mL EP管中，管內(nèi)含0.5 mL保存液。

（2）將含拭子的保存液EP管震蕩20 s，然后低速(2000 rpm)瞬離（5 s），將管蓋上的液體離心下去。

（3）打開蓋子，槍頭插到底部，吸取50 μL溶液。轉(zhuǎn)移到200 μL的EP管中。

（4）將上述200 μL EP管中加入5 μL裂解液，吹打混勻10次。

（5）將EP管上PCR儀，95 ℃10 min。

（3）2000 rpm離心2分鐘，將各類細(xì)胞碎片離心到管底。打開蓋子，取4 μL上清作為模板(在液面取樣，吸頭不要插到管底)，加入PCR體系。

1. qPCR 反應(yīng)液的準(zhǔn)備

（1）根據(jù)所要檢測(cè)樣品的數(shù)量，計(jì)算所需反應(yīng)孔數(shù)，每個(gè)樣本做單復(fù)孔。

反應(yīng)孔數(shù)=1個(gè)陽性PCR質(zhì)控+1個(gè)陰性PCR質(zhì)控+樣本數(shù)

（2）根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算所需的qPCR Mix 總量（需有1孔的加樣損失量）：

Mix =（反應(yīng)孔數(shù)+1）×16 μL

（3）各試劑放室溫融化，并根據(jù)下表所示準(zhǔn)備 qPCR Mix：

表2 qPCR Mix的配制

 qPCR 反應(yīng)體系及條件（反應(yīng)體系以20 μL為例）：

加樣

（1）震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。

（2）向每孔反應(yīng)管中分裝 16 μL qPCR Mix。

（3）向已分裝過 qPCR Mix 的反應(yīng)管中加入15 μL石蠟油。

（4）向反應(yīng)管中穿過石蠟油層加樣，3000 rpm 瞬離5 s，加樣示例如下：

表 3 加樣示例

PCR 儀設(shè)置以 SLAN96為例，溶解曲線模式，通道選擇FAM和ROX：

 【結(jié)果判讀】三個(gè)位點(diǎn)的基因型判讀如下所示：

注：陰性對(duì)照應(yīng)無熔解峰；溫度偏離峰±1℃屬正常現(xiàn)象。

【參考文獻(xiàn)】

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