小鼠端粒長度檢測試劑盒使用說明書(定量PCR法)

【產(chǎn)品規(guī)格】

1. TLM50  50*2*3 Reaction

【產(chǎn)品說明】

端粒（Telomeres）：是真核生物線性染色體末端的非編碼串聯(lián)重復(fù)性(TTAGGG)n陣列，端粒長度的變化，與衰老、癌癥、或神經(jīng)退行性等多種疾病相關(guān)。定量PCR法是檢測端粒長度的經(jīng)典技術(shù)，用時短，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于批量樣本檢測。

本產(chǎn)品試劑盒采用熒光 qPCR（SYBRgreen）檢測端粒長度，檢測對象為血液、組織DNA或細(xì)胞DNA。該試劑盒具有以下特點(diǎn)。

1. 穩(wěn)定：全程閉管操作，無交叉污染。

2. 方便：操作簡單，無需電泳步驟。

3. 相對定量：引入一個端粒長度檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，用于構(gòu)建標(biāo)曲得到擬合方程，可獲得樣品的相對長度（T/S）。

【運(yùn)輸及存條件】 

低溫冷凍運(yùn)輸， -20℃保存，有效期 6個月，凍融以后，4℃保存，有效期2周。

【產(chǎn)品組分】

注：本試劑盒提供試劑，使用前請上下輕柔顛倒十次混勻，后低速離心、小心開啟。避免起泡。實(shí)驗(yàn)時，操作須全程在冰上進(jìn)行 。Biowing?Telomere Detection Mix 啟用后避免反復(fù)凍融，使用結(jié)束后置于4℃保存，兩周內(nèi)使用完畢。Standard 1是C57幼鼠鼠尾DNA，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，端粒具體算法見附錄2。

【操作步驟】

1. 樣品準(zhǔn)備及質(zhì)控

端粒長度檢測與樣本質(zhì)量相關(guān)性較大，DNA質(zhì)量要求較高，如果對一批樣本進(jìn)行檢測，若利用不同提取方式或者不同提取試劑盒提取的DNA，以及質(zhì)量較差的DNA，我們建議對樣本DNA進(jìn)行純化，保證樣本的均一化。純化的方式本方案采用磁珠分選的方法，具體    步驟見附錄1。若采用其他純化方式如乙醇法純化、過柱純化，可自行嘗試；純化后的A260/280及A260/230的比值基本相同，在1.3-2.0之間。

將樣本濃度標(biāo)化至10ng/μL，上樣2μL。標(biāo)準(zhǔn)品的DNA濃度標(biāo)化至20ng/μL，按2倍、4倍、6倍濃度梯度稀釋后，上樣2μL，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線（其中端粒通道DNA上樣量40ng 、20ng、10ng、5ng；內(nèi)參通道DNA上樣量為40ng 、20ng、10ng）。

2. qPCR反應(yīng)液的準(zhǔn)備

(1) 根據(jù)所要檢測樣品的數(shù)量，計(jì)算所需反應(yīng)孔數(shù)，每個樣本兩個基因，分別做3 個重復(fù)孔。

端粒反應(yīng)孔數(shù)=（Standard1 × 4 個梯度）× 3 +（ 樣本數(shù)）× 3

內(nèi)參反應(yīng)孔數(shù)=（Standard1 × 3 個梯度）× 3 +（ 樣本數(shù)）× 3

(2) 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算所需的 Mix 總量（含有 1孔的加樣損失量）：

Mix（端?；騼?nèi)參） =（反應(yīng)孔數(shù)+1）× 18μl

(3) 各試劑放 2-8℃條件下融化，并根據(jù)下表所示準(zhǔn)備 qPCR Mix：

3. 加樣

（1）震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。

（2）向每孔反應(yīng)管中分裝 18μL qPCR Mix。

（3）向已分裝過 qPCR Mix 的反應(yīng)管中加入10ul石蠟油。

（4）向反應(yīng)管中加入樣品后短暫離心，加樣示例如下：

注：蓋上八聯(lián)管蓋或者光學(xué)膜后蓋上反應(yīng)管蓋子或者貼上光學(xué)膜，為避免影響熒光信號讀取，請注意不要在管蓋或者膜上做標(biāo)記，或者用刮板反復(fù)摩擦。反應(yīng)管短時低速離心，將管壁液體收集至管底；充分震蕩混勻后，再短時低速離心，將管蓋和管壁的殘留液體收集至底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

PCR儀設(shè)置以 宏石SLAN 96S 為例，其他型號定量PCR儀應(yīng)通過標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行參數(shù)校正或咨詢專業(yè)技術(shù)人員。

【閾值設(shè)置】

1. 以宏石SLAN-96S為例，擴(kuò)增曲線算法選擇絕對熒光值法，基線設(shè)置在2-7個循環(huán)

2. 閾值設(shè)定：以標(biāo)準(zhǔn)品CT值設(shè)置內(nèi)參和端粒擴(kuò)增曲線閾值，將內(nèi)參的CT值定為 25±1，將端粒的CT值定為 9-12 。閾值的設(shè)定要保證樣本及標(biāo)準(zhǔn)品的3重復(fù)的△CT在0.3以內(nèi)。

3. 閾值設(shè)置以后，如下圖所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線個的濃度梯度之間呈現(xiàn)較好的CT差異，端粒通道和內(nèi)參通道的△CT均在 1 左右。

說明：

（1）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 若最后一個濃度梯度的CT值過大，表明試劑盒擴(kuò)增效率下降或儀器運(yùn)行障礙。

（2）調(diào)整閾值線后，標(biāo)準(zhǔn)品的幾個濃度梯度之間的△CT相差過大，說明操作有誤。

備注：

端粒長度計(jì)算方法見附錄2

附錄 1

磁珠法純化DNA參考步驟

使用英萊盾 LD102-060 DNA 片段篩選功能磁珠試劑盒，在純化DNA的同時可以去除不良樣本中因降解產(chǎn)生的小片段DNA。磁珠上樣量已經(jīng)經(jīng)過摸索在保證得率的情況下，最大程度的去除小片段。

準(zhǔn)備工作：

將磁珠由 2-8℃中取出，室溫平衡至少 30min，配制 80%乙醇。

Step1 渦旋震蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

Step2 結(jié)合（吸附目的片段）

1. 取樣本DNA（建議DNA總量>500ng，體積>20μL）,向樣本DNA中加入0.6倍樣本DNA體積的磁珠，使用移液器小心吹打 10 次；

2. 室溫靜置 5min；

3. 室溫 12000rpm 離心 30s（該步驟可以加速聚集磁珠，可選）；

4. 將離心管置于磁力架上至溶液完全澄清（約 1min），棄去上清。

Step3 清洗

保持離心管固定于磁力架上，加入  80%乙醇（加入的體積視情況而定，若在1.5ml離心管中純化加入200μL，在200μL離心管中純化加入100μL），靜置 1min，無需重懸磁珠，棄去上清（保持離心管固定于磁力架上）；重復(fù)該操作一次。

Step4 除醇

保持離心管置于磁力架上，靜置通風(fēng) 2-5min 除醇。

注：除醇過程中請勿過分干燥磁珠，否則會降低純化效率。

Step5 洗脫

1. 將離心管從磁力架上取下，加入 30μL 洗脫液（建議使用TE，水洗脫可能會降低純化效率）洗脫，使用移液器小心吹打 10 次；

2. 室溫靜置 5min；

3. 室溫 12000rpm 離心 30s（該步驟可以加速聚集磁珠，可選）；

4. 將離心管置于磁力架上至溶液完全澄清（約 1min），待磁珠完全吸附后將上清轉(zhuǎn)移至新樣品管中備用。

 附錄 2

結(jié)果與計(jì)算 

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

以標(biāo)準(zhǔn)品3個或4個濃度梯度下的平均CT值為橫坐標(biāo)，log₂濃度為縱坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線

2. 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的T/S

將樣本的端粒和內(nèi)參通道的CT值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可得到樣本的T/S

下圖為兩個小鼠組織樣本（2月齡、24月齡）的計(jì)算示例