【產(chǎn)品規(guī)格】

                  TL50-02  50*3 Reactions 

【產(chǎn)品說明】

                端粒（Telomeres）：是真核生物線性染色體末端的非編碼串聯(lián)重復(fù)性(TTAGGG)n陣列，端粒長度的變化，與衰老、癌癥、或神經(jīng)退行性等多種疾病相關(guān)。qPCR法是檢測端粒長度的經(jīng)典技術(shù)，用時短，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于批量樣本檢測。

               本產(chǎn)品采用雙色熒光 qPCR（SYBRgreen+VIC）檢測端粒長度，檢測對象為血液、細(xì)胞DNA。相關(guān)信息見參考文獻(xiàn)【1】。端粒長度數(shù)據(jù)呈現(xiàn)兩種方式：相對長度（T/S）和平均端粒長度(bp)。

該試劑盒具有以下特點(diǎn)：

               1. 方便：操作簡單。 

       2. 可靠：端粒與內(nèi)參單管檢測，減少孔間干擾。內(nèi)參基因?yàn)槎嗫截悾c端粒量差降低。

       3. 準(zhǔn)確：引入已知端粒絕對長度的標(biāo)準(zhǔn)品和校正品，一個用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，一個用于校正，

           可同時獲得樣品的相對長度（T/S）和絕對長度。

【運(yùn)輸及保存條件】

              低溫冷凍運(yùn)輸，-20 ℃保存，有效期 6個月，凍融不超過3次。

【產(chǎn)品組分】

             1. Primer&Probe 先12000 rpm離心5 min，每管再用705 μL RNase Free Water復(fù)溶。

             2. 本試劑盒提供的試劑，使用前請上下輕柔顛倒十次混勻，后低速離心、小心開啟。避免起泡。實(shí)驗(yàn)時，操作須全程在冰上進(jìn)行。

             3. 實(shí)驗(yàn)除上述組分外，標(biāo)準(zhǔn)品和校正品需要在本公司單獨(dú)購買(貨號：TL3-S&C），其中標(biāo)準(zhǔn)品用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，校正品用于獲得校正系數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)品和校正

                品具體算法見附錄3）；DNA純化液和DNA片段篩選功能磁珠也需要在本公司單獨(dú)購買（貨號：TL50-P），用于純化DNA。

【操作步驟】

 1. 樣品準(zhǔn)備及質(zhì)控（見附錄1）

 2. qPCR反應(yīng)液的準(zhǔn)備

     (1)  根據(jù)所要檢測樣品的數(shù)量，計(jì)算所需反應(yīng)孔數(shù)，每個樣本做3 個重復(fù)孔。反應(yīng)孔數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)品× 3個梯度× 3+（校正品+樣本數(shù)）× 3（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

                或反應(yīng)孔數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)品× 3+ 樣本數(shù)× 3（△△Ct法）

     (2)  根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算所需的 Mix 總量（含有 1孔的加樣損失量）：Mix =（反應(yīng)孔數(shù)+1）× 25 μL

     (3)  各試劑放室溫條件下融化，并根據(jù)下表所示準(zhǔn)備 qPCR Mix：

3. 加樣

  (1)  震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。

  (2)  向每孔反應(yīng)管中分裝25 μL qPCR Mix。

  (3)  向已分裝過 qPCR Mix 的反應(yīng)管中加入15 μL石蠟油。

  (4)  向反應(yīng)管中穿過石蠟油層加入樣品后短暫離心，加樣示例如下：

標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

△△Ct法：

注：蓋上八聯(lián)管蓋或者光學(xué)膜后蓋上反應(yīng)管蓋子或者貼上光學(xué)膜，為避免影響熒光信號讀取，請注意不要在管蓋或者膜上做標(biāo)記，或者用刮板反復(fù)摩擦。

4. qPCR反應(yīng)條件

PCR儀設(shè)置以 宏石SLAN 96S 為例，其他型號定量PCR儀應(yīng)通過標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行參數(shù)校正或咨詢專業(yè)技術(shù)人員。

【閾值設(shè)置】

          1.   以宏石SLAN-96S為例，擴(kuò)增曲線算法選擇絕對熒光值法，基線設(shè)置在2-7個循環(huán)。

         2.  閾值的設(shè)定要保證樣本及標(biāo)準(zhǔn)品的3重復(fù)的△Ct在0.3以內(nèi)。

         3.  閾值設(shè)定：內(nèi)參和端粒擴(kuò)增曲線閾值拉同一根線，都定為700；40 ng 標(biāo)準(zhǔn)品端粒的Ct值定為13±1，內(nèi)參的Ct值定為18±1；標(biāo)準(zhǔn)品端粒和內(nèi)參的△Ct為5±0.5。

         4.  閾值設(shè)置以后，如下圖所示，標(biāo)準(zhǔn)品 3個濃度梯度之間呈現(xiàn)較好的Ct差異，端粒通道和內(nèi)參通道的△Ct均在0.8左右。

說明：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，若R2＜0.99，表明操作有誤。

備注：

      1.   標(biāo)準(zhǔn)品、校正品的絕對長度，請咨詢上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司。產(chǎn)品批次不同，絕對長度會有差異。

     2.  如果檢測樣本為血液DNA，可以將所得端粒相對長度在上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司構(gòu)建的5000例中國人群數(shù)據(jù)庫比對，評估樣本個體端粒的相對長度；

          若選用其他樣本，建議自行構(gòu)建數(shù)據(jù)庫并做進(jìn)一步分析。

     3.  端粒長度計(jì)算方法見附錄3。

附錄 1

樣本及標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備和質(zhì)控

1. 樣品前處理

  1.1 血液樣本

血液樣本建議在﹣20℃保存，本試劑盒支持從淋巴細(xì)胞中分選的白細(xì)胞或血液經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理分選的白細(xì)胞進(jìn)行核酸抽提，

建議采用天根的血液基因組DNA提取試劑盒(DP348)抽提DNA，用于后續(xù)端粒長度的檢測。

 1.2 細(xì)胞樣本

建議采用天根的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒(DP304)抽提DNA，用于后續(xù)端粒長度的檢測。

 1.3 唾液樣本

唾液樣本需要細(xì)胞分選再抽提DNA，分選操作較復(fù)雜，建議咨詢本公司技術(shù)人員。

2. 樣本質(zhì)量的標(biāo)化

端粒長度的測定與樣本質(zhì)量相關(guān)性較大，DNA質(zhì)量要求較高，需要對樣本及標(biāo)準(zhǔn)品DNA純化，保證樣本的均一化。樣本DNA經(jīng)DNA純化液處理（37 ℃ 金屬浴30 min，90 ℃ 金屬浴2 min）后，

可根據(jù)樣品的質(zhì)量分別采用磁珠分選或割膠回收的方法，具體參考如下：

    （1）磁珠分選方法：經(jīng)DNA純化液純化后，如果樣本DNA質(zhì)量較好(參考下圖泳道4-6），采用磁珠分選方法。詳細(xì)純化DNA步驟見端粒長度 DNA純化試劑盒說明書。

    （2）割膠回收方法：經(jīng)DNA純化液純化后，如果樣本DNA質(zhì)量較差(參考下圖泳道1-3），采用割膠回收方法。具體操作：取1 μg樣本進(jìn)行0.7-0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，

使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(9762)回收純化DNA片段，回收效率10%-30%，和基因組DNA的完整程度有關(guān)。

3. 樣本濃度的標(biāo)化  

3.1△△Ct法

磁珠分選樣品：樣本和標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)化至4 ng/μL，上樣5 μL，通過△△Ct法計(jì)算端粒長度。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法

方法一：經(jīng)磁珠分選的樣本DNA濃度標(biāo)化至4 ng/μL，上樣5 μL。標(biāo)準(zhǔn)品的DNA濃度標(biāo)化至8 ng/μL，按2倍和4倍梯度稀釋后，上樣5 μL，

用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線（3個梯度的DNA總上樣量分別為40 ng、20 ng、

      10 ng）。校正品的DNA濃度標(biāo)化至4 ng/μL，上樣5 μL，用于校正。具體計(jì)算詳見附錄3。

標(biāo)準(zhǔn)品具體稀釋方法見下圖，連續(xù)的稀釋方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線R2需達(dá)到0.99以上。

方法二：經(jīng)割膠回收的樣本、標(biāo)準(zhǔn)品和校正品濃度標(biāo)化方法同上。

注：樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的濃度過高或過低會影響擴(kuò)增效率，對實(shí)驗(yàn)造成干擾，測量結(jié)果誤差較大。

附錄 2

   割膠回收推薦使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(9762)，具體操作詳見說明書。

附錄 3

   結(jié)果與計(jì)算 

   方法一：△△Ct法

         端粒長度計(jì)算方法（T/S）：先分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的△Ct=Ct（端粒）-Ct（內(nèi)參）

再計(jì)算 T/S=2^{-(△Ct（樣品）-△Ct（標(biāo)準(zhǔn)品）)}

注：T為待測樣品，S為標(biāo)準(zhǔn)品，T/S為待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的端粒相對長度比， 絕對長度=標(biāo)準(zhǔn)品長度*T/S

   方法二：標(biāo)準(zhǔn)曲線法

 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

      以標(biāo)準(zhǔn)品3個濃度梯度下的平均Ct值為橫坐標(biāo)，3個梯度的Log2上樣量為縱坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品端粒通道Ct值

表2 標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)參通道Ct值

  2. 利用標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算校正品的T/S

            將校正品的端粒和內(nèi)參通道的Ct 值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可得到校正品的T/S。

表3 校正品的T/S計(jì)算過程

3. 校正系數(shù)的計(jì)算

           已對標(biāo)準(zhǔn)品和校正品的端粒長度做TRF檢測，絕對端粒長度已知（假定標(biāo)準(zhǔn)品的絕對長度為5430 bp，校正品的絕對長度為5100 bp），按照下圖示即可得到用于校正樣品的校正系數(shù)。

表4 校正品的校正系數(shù)

4. 樣本T/S以及絕對長度的計(jì)算

表5 樣本的T/S計(jì)算

注：本表中校正系數(shù)源自表4中計(jì)算出的校正系數(shù),本表中標(biāo)準(zhǔn)品絕對長度為5430 bp

附錄4

相關(guān)產(chǎn)品

參考文獻(xiàn)：

【1】Sun G, Cao H, Bai Y, Wang J, Zhou Y, Li K, Xiao JH. A novel multiplex qPCR method for assessing the comparative lengths of telomeres. J Clin Lab Anal. 2021 Sep;35(9):e23929. doi: 10.1002/jcla.23929. Epub 2021 Aug 4. PMID: 34347924; PMCID: PMC8418462.