【產(chǎn)品規(guī)格】

        TL3-S&C   3 Tests

【產(chǎn)品說(shuō)明】

   該產(chǎn)品為已純化的基因組DNA，用于 qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和校正系數(shù)的計(jì)算。

【運(yùn)輸及保存條件】

   低溫冷凍運(yùn)輸，-20℃保存，有效期6個(gè)月。

【產(chǎn)品組分】

標(biāo)準(zhǔn)品和校正品先12000 rpm離心5 min，離心后小心開(kāi)啟，每管再分別用60 μL RNase Free Water復(fù)溶。使用時(shí)請(qǐng)上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。

【操作步驟】

1、qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

       1.1  標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量的標(biāo)化

  標(biāo)準(zhǔn)品DNA和校正品DNA經(jīng)DNA純化液純化后，用DNA分選磁珠進(jìn)行分選，具體操作步驟見(jiàn)端粒長(zhǎng)度DNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)（TL50-P）。

      1.2  標(biāo)準(zhǔn)品濃度的稀釋

      DNA磁珠分選后的標(biāo)準(zhǔn)品中的DNA標(biāo)化為8 ng/μL，體積為40 μL（標(biāo)為管1），從管1中吸取20 μL，加入到管2中，另外加入20 μL RNase Free Water（客戶自備）

  得到溶液2；在管3中加入20 μL溶液2，另外加入20 μL RNase Free Water得到溶液3。連續(xù)的稀釋方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線R²可達(dá)到0.99左右。

      1.3 校正品濃度的稀釋

      DNA磁珠分選后的校正品中的DNA標(biāo)化為4 ng/μL，體積為20 μL。

2、加樣

  各反應(yīng)孔加樣示例

3、結(jié)果與計(jì)算

     3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

  以標(biāo)準(zhǔn)品3個(gè) 濃度梯度下的平均 Ct值為橫坐標(biāo) ， 3個(gè)梯度 的 Log₂上樣量為縱坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線圖示：

表1 標(biāo)準(zhǔn)品端粒通道Ct值

表2 標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)參通道Ct值 

     3.2 利用標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算校正品的T/S

    將校正品的端粒和內(nèi)參通道的Ct 值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可得到校正品的T/S。

表3 校正品的T/S計(jì)算過(guò)程

     3.3 校正系數(shù)的計(jì)算

   已對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和校正品的端粒長(zhǎng)度做TRF檢測(cè)，絕對(duì)端粒長(zhǎng)度已知（假定標(biāo)準(zhǔn)品的絕對(duì)長(zhǎng)度為5430 bp，校正品的絕對(duì)長(zhǎng)度為5100 bp），按照下圖示即可得到   用于校正樣品的校正系數(shù)。

表4 校正品的校正系數(shù)

   3.4 樣本T/S以及絕對(duì)長(zhǎng)度的計(jì)算

表5 樣本的T/S計(jì)算

本表中校正系數(shù)源自表4中計(jì)算出的校正系數(shù)，本表中標(biāo)準(zhǔn)品絕對(duì)長(zhǎng)度為5430 bp。

注：樣品及標(biāo)準(zhǔn)品濃度過(guò)高或過(guò)低會(huì)影響擴(kuò)增效率，對(duì)實(shí)驗(yàn)造成干擾，測(cè)量結(jié)果誤差較大。

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