細菌、真菌混合快檢試劑盒使用說明書(定量PCR法)

【產(chǎn)品規(guī)格】

B&F01  100 Reactions/盒

【產(chǎn)品說明】

基于TaqMan探針熒光定量PCR原理的檢測方案：選擇細菌（金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草牙孢桿菌、銅綠假胞桿菌）和真菌（白色念珠菌和黑曲霉）基因中特異基因片段，分別設(shè)計引物和熒光探針，快速檢測4種細菌和2種真菌的基因組DNA。

結(jié)合相關(guān)的樣本前處理和DNA抽提方案，本試劑盒可以檢測各類生物制品和細胞培養(yǎng)物中潛在的金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草牙孢桿菌、銅綠假胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉污染。    靈敏：配合推薦使用的核酸抽提方案，檢測靈敏度達到10CFU/mL。

  可靠：抽提加入內(nèi)標核酸，全過程質(zhì)量控制。  

 穩(wěn)定：全程閉管操作，無交叉污染。

快捷：單管可同時檢測6種菌種，檢測效率高。

準確：樣本設(shè)置3重復(fù)，避免假陰、陽性的出現(xiàn)。

【有效期】

規(guī)定儲存條件下6個月。

-20 ℃取出后，可避光存放于4 ℃繼續(xù)使用1周。

【產(chǎn)品組分】

表1   產(chǎn)品組分

注：

1、Bacterial&Fungus Positive Control含4種細菌DNA、2種真菌DNA和內(nèi)標DNA。

2、Internal Standard含有內(nèi)標DNA。

在實驗前請完整閱讀本說明書，務(wù)必重視注意事項和無菌操作規(guī)范！

【操作步驟】

1.樣本制備

（1） 樣本的標準制備方案：請配合使用高效無微生物污染的DNA抽提試劑盒提取樣本DNA。整個過程需要遵守?zé)o菌操作規(guī)范。本公司目前推薦抽提試劑盒見附錄2。直接取20 μL待測樣本DNA，作為模板進行 qPCR 反應(yīng)。

（2） 前處理陰性樣本準備方案：將RNase Free Water當成樣本，加入內(nèi)部質(zhì)控（Internal standard），進行核酸抽提。

1. qPCR 反應(yīng)液的準備

（1） 根據(jù)所要檢測樣品的數(shù)量，計算所需反應(yīng)孔數(shù)，每個樣本做3個重復(fù)孔。

反應(yīng)孔數(shù)=1個陽性PCR質(zhì)控 PC +1個陰性PCR質(zhì)控+1個樣本前處理陰性質(zhì)控+樣本數(shù)× 3

（2） 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計算所需的 Mix 總量（需有1孔的加樣損失量）：

Mix =（反應(yīng)孔數(shù)+1）×10μL

（3） 各試劑放室溫融化，并根據(jù)下表所示準備 qPCR Mix：

表2  qPCR Mix的配制

2. 加樣

（1）震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。

（2）向每孔反應(yīng)管中分裝 10 μL qPCR Mix。

（3）向反應(yīng)管中加入樣品后短暫離心，加樣示例如下：

表 3 加樣示例

【注】：此時每個反應(yīng)孔的體積為30μL

PCR 儀設(shè)置以 ABI 7500 為例，相對定量模式，選擇

TaqMan 探針法：

注：    1、該程序為兩階段擴增法，如熒光定量PCR儀可以兩階段收集熒光，按照正常Ct值判斷結(jié)果；如果只能最后一步收集熒光，需要在原數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上加15個Ct值。

2、ROX設(shè)置是以7500為例，也存在例外，例如StepOne。

【閾值設(shè)置】

以ABI 7500 為例，擴增曲線選擇 log 法，基線設(shè)置1~2 個循環(huán)。建議用 log 法擴增曲線保證結(jié)果穩(wěn)定可靠。

（1）內(nèi)參(CY5)閾值設(shè)定：以陽性性對照定內(nèi)參擴增曲線閾值，將內(nèi)參的CT 值定為 29±2。

（2）細菌 (FAM)閾值設(shè)定：以陽性對照定細菌擴增曲線閾值，將細菌(FAM)的CT值定為 29±2。

（3）真菌(HEX)閾值設(shè)定：以陽性對照定細菌擴增曲線閾值，將真菌(HEX)的CT值定為 29±2。

【實驗質(zhì)量控制】：

如果陽性對照管的細菌(FAM)和真菌(HEX)Ct 值均>31，但陽性對照管及陰性對照管的內(nèi)參(CY5)Ct 值正常，表明陽性對照模板有降解。

如果樣品前處理陰性（CY5)Ct 值>32，陽性對照管的內(nèi)參(CY5)Ct 值>31 ，表明內(nèi)參DNA存在降解或PCR體系擴增效率下降。

【結(jié)果判讀】

根據(jù)細菌(FAM) Ct 值、真菌(HEX) Ct 值、內(nèi)標(CY5) Ct 值判定，具體標準如下：

注：結(jié)果判讀

1. 要求每個檢測樣品做3重復(fù)，如果3復(fù)孔中，兩重復(fù)為陽性，則判讀為陽性。

2. 建議做樣本前處理陰性，可以質(zhì)控整個抽提過程。

3. 如果待測樣本反應(yīng)中僅有FAM和CY5通道有擴增，表明存在細菌污染，若要進一步確認是何種細菌污染，推薦使用細菌檢測試劑盒（貨號：BD01和BD02）。

4. 如果待測樣本反應(yīng)中僅有HEX和CY5通道有擴增，表明存在真菌污染，若要進一步確認是何種真菌污染，推薦使用細菌檢測試劑盒（貨號：FD01）。

注：檢測結(jié)果異常時

5. 樣品前處理陰性：內(nèi)參Ct值過大，表明抽提效率低；細菌和真菌檢測通道Ct值小于37，可能前處理抽提過程存在污染。

6. qPCR陰性：細菌檢測通道 Ct 值小于37，操作過程存在污染。

7. 樣本前處理處理陰性質(zhì)控 PCR陰性質(zhì)控內(nèi)參差±1個 Ct 值屬于正?，F(xiàn)象。

【 PCR過程注意事項】

由于 PCR 反應(yīng)非常靈敏，實驗操作中應(yīng)注意以下事項，以免發(fā)生DNA 污染：

1、試劑盒開啟后，陽性對照應(yīng)與試劑 Mix、陰性對照分開存放。

2、每個組分在使用前都應(yīng)先低速離心后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。

3、要求核酸抽提和qPCR過程都符合無菌操作規(guī)范。

4、建議自備轉(zhuǎn)運盒，用于將配制分裝好的Mix從配置Mix超凈工作臺轉(zhuǎn)運到加樣超凈工作臺。

5、建議在 qPCR 反應(yīng)板上陽性對照的排布應(yīng)遠離待測樣本和陰性對照。

6、建議 qPCR 配置與分裝在一個無菌操作臺，樣本的加樣在另外一個無菌操作臺。

7、建議使用不同的移液器添加陽性對照與待測樣本、陰性對照，并使用帶濾芯的槍頭進行加樣。

8、應(yīng)按照先加陰性，再加樣本，最后加陽性的順序加樣。且陽性用專門的加樣器。建議陽性在專門的無菌操作臺加樣。

9、qPCR 反應(yīng)板封膜或蓋蓋子時須反復(fù)壓緊。

10、上機擴增前，反應(yīng)管短時低速離心，將管壁液體收集至管底。

11、蓋上反應(yīng)管蓋子或者貼上光學(xué)膜后，為避免影響熒光信號讀取，請注意不要在管蓋或者膜上做標記，或者用刮板反復(fù)摩擦。

【附錄 1適用熒光定量 PCR 儀品牌型號】

注：適用熒光定量PCR 儀為迄今為止我們客戶配備的定量儀器品牌型號，如您的熒光定量 PCR 儀不在我們列出的范圍，也歡迎聯(lián)系我們，申請試用。

無菌操作規(guī)范

1、除高速離心機外，其他設(shè)備和耗材應(yīng)放在無菌操作臺中，保證無菌。

2、樣本高速離心后，要對離心管噴酒精，并用棉球擦拭離心管外壁，同時更換干凈的板架和新手套。

3、實驗前用75%酒精擦凈臺面及四周，放好需用的實驗器材及各種溶液，并用酒精棉球擦拭，更換干凈的管架。

4、對著桌面，空間噴灑酒精，然后將超凈工作臺通風(fēng)機打開，超凈工作臺和紫外燈打開 30～45 分鐘，再將無菌室紫外燈打開 30～45 分鐘后關(guān)閉，再通風(fēng) 15 分鐘。關(guān)閉紫外，拉開小一半隔離，用酒精棉球擦拭超凈工作臺桌面2遍，關(guān)上隔離。

5、進入無菌室操作前，雙手及在操作臺內(nèi)手臂部分用75%的酒精擦拭消毒。穿專用工作服、帽及拖鞋、口罩，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。

6、無菌室溫度宜控制在 18～28℃，濕度在 45%～65%（溫濕度計應(yīng)該用無水的）。

7、從槍頭盒中取出槍頭時，尖部不能觸及外露部位及離心管和管架邊。

8、操作盡量在酒精燈前操作。打開離心管前，酒精燈灼燒鑷子，待冷卻后用鑷子開關(guān)管蓋。

9、操作中，不能在樣品上方翻轉(zhuǎn)瓶蓋，袖口不能掠過樣品上方。

10、實驗完畢，清潔臺面。

11、實驗者在實驗后用肥皂清洗雙手。

12、換下的專用實驗服，進行紫外線，一次性鞋套額帽子扔進垃圾桶。

13、用畢，再開紫外燈消毒 30分鐘。

14、無菌室和緩沖間定期大掃除，保持整潔。

15、定期檢查紫外燈燈管。每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。如燈管發(fā)黑，超過使用期限，及時更換紫外燈管。

2、注意事項

(1)工作臺面上，禁止存放不必要的物品，以保證工作區(qū)域內(nèi)的潔凈氣流不受干擾。

(2)禁止在工作臺面上記錄，工作時應(yīng)盡量避免作明顯擾亂氣流的動作。(3)根據(jù)環(huán)境潔凈度，每 3~6 個月將中效過濾器中的濾料拆下清洗。一般情況下，當無紡布濾料容納塵埃較多、表面發(fā)黑時即可拆下進行清洗，或者予以更換。

(4)風(fēng)機轉(zhuǎn)速調(diào)至最大時，仍不能達到所需要的風(fēng)速時（即風(fēng)速≤0.2m/s）,則必須更換高效空氣過濾器。