CHO 殘留 DNA 檢測試劑盒(探針法）

【產(chǎn)品規(guī)格】

CHO 100 100 Reactions/盒

【產(chǎn)品說明】

Biowing? CHO 殘留 DNA 檢測試劑盒用于定量檢測各種生物制品的中間品、半成品和成品中 CHO 宿主細(xì)胞 DNA。

本試劑盒采用一套引物探針在FAM通道定量檢測樣品中 CHO 殘留 DNA，另外一套引物探針在HEX通道檢測內(nèi)參DNA。

該試劑盒具有以下特點(diǎn)：

靈敏：最低檢測限可低至1 fg/μL。

簡單：標(biāo)曲定量參考品預(yù)分裝并凍干，繪制標(biāo)曲簡單。

可靠：試劑盒配套有CHO DNA 定量參考品，已溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)品；抽提加入內(nèi)參核酸，全過程質(zhì)量控制。

準(zhǔn)確：樣品加標(biāo)回收，評估 DNA 提取的效率、回收率和準(zhǔn)確度，評估驗證分析方法和系統(tǒng)性能，進(jìn)一步保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

快捷：操作時間短，3 h內(nèi)出結(jié)果。

【運(yùn)輸及保存條件】

低溫冷凍運(yùn)輸，-20 ℃保存，有效期1年；使用后仍存放在

-20 ℃，不可反復(fù)凍融超過三次。

【產(chǎn)品組分】

A:

B:

注：本試劑盒提供的其他試劑，使用前先低速離心后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。

【操作步驟】

1. 產(chǎn)品組分的復(fù)溶

Biowing?CHO Primer&Probe Mix、內(nèi)部質(zhì)控（IC）、CHO DNA 定量參考品（1 pg/μL）用12000 rpm 離心2 min后，分別用242 μL/管和220 μL/管、275 μL/管RNase Free Water復(fù)溶，混勻1min后瞬離。

2. qPCR 反應(yīng)液的準(zhǔn)備

（1）根據(jù)所要檢測樣品的數(shù)量，計算所需反應(yīng)孔數(shù)，每個樣本做3復(fù)孔。

反應(yīng)孔數(shù)=1個無模板對照NTC+1個陰性質(zhì)控 NCS+（5個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線+樣本數(shù)+加標(biāo)回收質(zhì)控 ERC）×3

（2）根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計算所需的qPCR Mix 總量（需有1孔的加樣損失量）：

Mix =（反應(yīng)孔數(shù)+1）×20 μL

（3）各試劑放室溫融化，并根據(jù)下表所示準(zhǔn)備 qPCR Mix：

表2 qPCR Mix的配制

3. 樣本制備（自備）

v 配制 CHO DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）取三條含CHO DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線定量參考品的8連管；

（2）5000 rpm離心10min；

（3）8連管的前五個孔中每個孔加入10μL RNase Free Water；

（4）渦旋振蕩混勻，短暫離心 5 秒；

（5）濃度依次為10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL。

v 待測樣品的制備

（1）取 200 μL 待測樣本加入 1.5 mL 干凈的離心管中，再加入 10 μL IC，標(biāo)記為樣品。

（2）待測樣品進(jìn)行樣品抽提前處理，制備成樣品純化液。

v 加標(biāo)回收質(zhì)控 ERC 的制備

根據(jù)需要設(shè)置 ERC 中的 CHO DNA 加樣濃度（以制備加 10 pg CHO DNA 量的樣品 ERC 為例），具體操作如下：

（1）取 200 μL 待測樣品加入 1.5 mL 干凈的離心管中。

（2）加入 10 μL CHO DNA 定量參考品（1 pg/μL），再加入 10 μL IC，混勻，標(biāo)記為樣品 ERC。樣品 ERC 和同批待測樣品一起進(jìn)行樣品抽提前處理，制備成樣品 ERC 純化液。

v 陰性質(zhì)控 NCS 的制備

（1）取 200 μL RNase Free Water加入 1.5 mL 干凈的離心管中，再加入 10 μL IC，標(biāo)記為陰性質(zhì)控 NCS。

（2）同待測樣品一起進(jìn)行樣品抽提前處理，制備成陰性質(zhì)控 NCS 純化液。

注：樣本抽提前處理具體見附錄1

4. 加樣

qPCR 反應(yīng)體系及條件反應(yīng)體系以30μL為例：

（1）震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。

（2）向每孔反應(yīng)管/CHO DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線定量參考品反應(yīng)管中分裝 20 μL qPCR Mix。

（3）向已分裝過 qPCR Mix 的反應(yīng)管中加入15 μL石蠟油。

（4）向反應(yīng)管中穿過石蠟油層加樣，3000 rpm 瞬離5 s，加樣示例如下：

表 3 加樣示例

注：建議其他不同類型樣本，先做適應(yīng)性驗證，因為不同樣本性質(zhì)不同。

PCR 儀設(shè)置以ABI 7500 為例，相對定量模式，選擇TaqMan 探針法：

【閾值設(shè)置】

以ABI 7500 為例，擴(kuò)增曲線選擇 log 法，基線設(shè)置3-15個循環(huán)。建議用 log 法擴(kuò)增曲線保證結(jié)果穩(wěn)定可靠。

（1） 內(nèi)參(HEX/VIC)閾值設(shè)定：以陰性質(zhì)控 NCS定內(nèi)參擴(kuò)增曲線閾值，將內(nèi)參的Ct 值定為 28±2。

（2） CHO(FAM)閾值設(shè)定：以標(biāo)曲最高濃度定CHO擴(kuò)增曲線閾值，將CHO(FAM)的Ct值定為19±2。

【結(jié)果判讀】

根據(jù)CHO(FAM) Ct 值判定是否發(fā)生CHO殘留，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：

1. 檢查內(nèi)參通道擴(kuò)增是否正常，擴(kuò)增曲線是否選擇log 法。

2. 內(nèi)參擴(kuò)增不正常，表明 PCR反應(yīng)未正常進(jìn)行，PCR 體系受到干擾，需重復(fù)檢測。

3. 內(nèi)參擴(kuò)增正常，結(jié)合 Ct 值和擴(kuò)增曲線形態(tài)判斷。

4. 無典型擴(kuò)增曲線，可認(rèn)為該樣本為CHO無殘留。有典型擴(kuò)增曲線，需重復(fù)檢測，重復(fù)結(jié)果不一致判為無殘留；結(jié)果一致，判為有殘留。

5. 根據(jù)待測樣品和樣品ERC的檢測結(jié)果計算加樣回收率，加樣回收率要求在50%～150%之間，具體算法見附錄4。

6. 上機(jī)結(jié)束后，在程序的右上角點(diǎn)擊“plate setup” 欄下的“Assign Targets and Samples/Assign target(s) to the selected wells”，選中標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)格，在右側(cè)的“Task”欄 下選擇“ ”，設(shè)置好每個梯度的重復(fù)孔，在“Quantity”下輸入所做的濃度，依次將標(biāo)準(zhǔn)品的梯度設(shè)置完成。

7. 點(diǎn)擊“Analysis”欄下的“Standard Curve”即可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2、擴(kuò)增效率（Eff%）和斜率（Slope）；正常的標(biāo)曲：R2＞0.99；擴(kuò)增效率在 90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)；Slope 在-3.4 左右。

【注意事項】

由于 PCR 反應(yīng)非常靈敏，實驗操作中應(yīng)注意以下事項，以免發(fā)生DNA 污染：

1. 建議分區(qū)操作和分區(qū)存放。

A區(qū)：樣本DNA提取，建議在超凈工作臺完成；

B區(qū)：配制mix和qPCR陰性加樣，建議在超凈工作臺完成；

C區(qū)：按照先加待測樣本，后配制標(biāo)曲的順序加樣；

D區(qū)：qPCR擴(kuò)增檢測。

2. 建議在 qPCR 反應(yīng)板上陽性對照的排布應(yīng)遠(yuǎn)離待測樣本和陰性對照；使用不同的移液器添加陽性對照與待測樣本、陰性對照，并使用帶濾芯的槍頭進(jìn)行加樣。

3. 試劑盒開啟后，試劑 Mix、陰性對照存放在B區(qū)，陽性對照應(yīng)存放在C區(qū)。

4. qPCR 封膜時須反復(fù)壓緊。

5. 每周用核酸清除劑清潔無菌操作臺、傳遞窗和桌面。

6. 垃圾建議當(dāng)場封閉并丟棄。

7. 對具體樣品的 DNA 加標(biāo)量設(shè)定在其無加標(biāo)測試值的 2-10 倍為宜。

8. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

【附錄 1 樣本抽提前處理方案】

在實驗前請完整閱讀本說明書，務(wù)必重視注意點(diǎn)！

n 樣品處理

樣品可手工抽提，也可機(jī)器抽提。

核酸抽提注意事項

? 請盡量在完成樣品純化處理當(dāng)天進(jìn)行后續(xù)的 DNA 檢測，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

? 手抽提取純化操作過程建議在二級生物安全實驗室或安全柜中進(jìn)行。

手抽樣品制備期間:

? 小心地將樣品溶液加到核酸吸附柱上。槍頭中的樣品進(jìn)入核酸吸附柱而不濕潤柱的邊緣。

? 不同液體在轉(zhuǎn)移之間更換槍頭。使用帶濾芯的槍頭。

? 避免用槍頭接觸核酸吸附膜。

【附錄 2相關(guān)設(shè)備耗材】

n 實驗所需但試劑盒中未含材料

? RNase Free Water

? 無水乙醇（分析純）

? PCR 8 連管或 96 孔板，相應(yīng)管蓋或覆膜

? 1000μL，100μL，10μL 無菌低吸附濾芯槍頭

? 1.5mL，2mL 無菌低吸附離心管

n 相關(guān)設(shè)備

? 迷你離心機(jī)

? 漩渦振蕩器

? 金屬浴

? 1000 μL，100 μL，10 μL 移液槍

? 熒光定量 PCR 儀

? 生物安全柜

? 微孔板迷你離心機(jī)

【附錄 3 無菌操作規(guī)范】

無菌操作規(guī)范

1、除高速離心機(jī)外，其他設(shè)備和耗材應(yīng)放在無菌操作臺中，保證無菌。

2、樣本高速離心后，要對離心管噴酒精，并用棉球擦拭離心管外壁，同時更換干凈的板架和新手套。

3、實驗前用1% 84消毒液擦凈臺面及四周，放好需用的實驗器材及各種溶液，并用酒精棉球擦拭，更換干凈的管架。

4、對著桌面，空間噴灑1% 84消毒液，然后將超凈工作臺通風(fēng)機(jī)打開，超凈工作臺和紫外燈打開 30～45 分鐘，再將無菌室紫外燈打開 30～45 分鐘后關(guān)閉，再通風(fēng) 15 分鐘。關(guān)閉紫外，拉開小一半隔離，用酒精棉球擦拭超凈工作臺桌面2遍，關(guān)上隔離。

5、進(jìn)入無菌室操作前，雙手在操作臺內(nèi)手臂部分用75%的酒精擦拭消毒。穿專用工作服、帽及拖鞋、口罩，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。

6、無菌室溫度宜控制在 18～28 ℃，濕度在 45%～65%（溫濕度計應(yīng)該用無水的）。

7、從槍頭盒中取出槍頭時，尖部不能觸及外露部位及離心管和管架邊。

8、操作盡量在酒精燈前操作。打開離心管前，酒精燈灼燒鑷子，待冷卻后用鑷子開關(guān)管蓋。

9、操作中，不能在樣品上方翻轉(zhuǎn)瓶蓋，袖口不能掠過樣品上方。

10、實驗完畢，清潔臺面。

11、實驗者在實驗后用肥皂清洗雙手。

12、換下的專用實驗服，進(jìn)行紫外線，一次性鞋套額帽子扔進(jìn)垃圾桶。

13、用畢，再開紫外燈消毒 30 分鐘。

14、無菌室和緩沖間定期大掃除，保持整潔。

15、定期檢查紫外燈燈管。每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。如燈管發(fā)黑，超過使用期限，及時更換紫外燈管。

16、每周用核酸清除劑清潔無菌操作臺、傳遞窗和桌面。

17、垃圾建議當(dāng)場封閉并丟棄。

2、注意事項

(1)工作臺面上，禁止存放不必要的物品，以保證工作區(qū)域內(nèi)的潔凈氣流不受干擾。

(2)禁止在工作臺面上記錄，工作時應(yīng)盡量避免作明顯擾亂氣流的動作。(3)根據(jù)環(huán)境潔凈度，每 3~6 個月將中效過濾器中的濾料拆下清洗。一般情況下，當(dāng)無紡布濾料容納塵埃較多、表面發(fā)黑時即可拆下進(jìn)行清洗，或者予以更換。

(4)風(fēng)機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)至最大時，仍不能達(dá)到所需要的風(fēng)速時（即風(fēng)速≤0.2m/s）,則必須更換高效空氣過濾器。

【附錄 4 核酸抽提儀日常清潔】

核酸抽提儀日常清潔

1．每周用核酸清除劑清潔一次，推薦使用近岸蛋白的Nucleic Acid Cleaner（M126-01A）。

2．每天實驗結(jié)束后用1% 84消毒液噴核酸抽提儀臺面和四周，然后用紙擦凈。

3．每天下班前打開核酸抽提儀的門通風(fēng)過夜。

4．如遇核酸抽提儀污染特別嚴(yán)重，可以先用清水先擦拭3遍，再用核酸清除劑和1% 84消毒液清潔，最后用紙擦凈。

5．實驗前，用84擦拭儀器和紫外照射約2.5個小時。

【附錄 4 樣品回收率】

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

以標(biāo)準(zhǔn)品 5個濃度梯度下的平均Ct值為縱坐標(biāo)，5個梯度的Log₁₀^上樣量為橫坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品回收率

(按照加入1 pg/μl CHO DNA 參考品計算）

注:洗脫體積按照100uL計算